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II Methoden

II.1 Arbeiten mit Proteinen

Alle Arbeiten mit Proteinen wurden soweit möglich auf Eis durchgeführt, und die

aufgereinigten Proteine wurden nach dem Aliquotieren bei -20°C gelagert.

1.1 Expression und Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen

Für die Transkription rekombinanter Proteine in E. coli-Zellen wurde ein pGEX-2T-GL

Vektor verwendet.

Das Prinzip dieses Vektor-Systems ist folgendes: Die rekombinanten Proteine werden als

Fusionsproteine mit der Glutathion-S-Transferase (GST) aus dem Fadenwurm Schistosoma

japonicum exprimiert und besitzen eine Thrombinschnittstelle zwischen GST-Anhang und

rekombinantem Protein. Der GST-Anhang dient der Isolierung der Proteine aus den

Bakterienzellen. Er bindet mit hoher Affinität an sein Substrat Glutathion und ermöglicht die

Aufreinigung über Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Glutathion. Durch

Abspaltung an der Thrombinschnittstelle mit Hilfe von Thrombin oder durch kompetitive

Elution mit einem Überschuss an reduziertem Glutathion kann das rekombinante Protein

gewonnen werden.

Die Expression des GST-Fusionsproteins steht unter der Kontrolle eines lac-induzierbaren

Promotors. Durch Zugabe von Isopropylthiogalaktosid (IPTG) kann die Transkription des

Genabschnitts gezielt induziert werden.

Ebenfalls auf dem pGEX-2T-GL-Plasmid kodiert ist ein Gen für β-Lactamase. Die β-

Lactamase ermöglicht es den Bakterien im ampicillinhaltigen Nährmedium zu überleben, so

dass die Bakterien, die das Plasmid tragen, selektiert werden.

Die Abkürzung „-GL“ steht für einen Abschnitt des pGEX-2T-Vektors, den „Glycin-Linker“,

der für fünf Glycinreste kodiert. Diese Glycinreste ermöglichen einen besseren Zugang zur

Thrombinschnittstelle und erleichtern die Abspaltung des GST-Proteins.

1.1.1 Expression in E. coli

Für die Expression der Proteine wurde zunächst eine Vorkultur aus der Glycerin-Kultur

angelegt. Das entsprechende Volumen LB-Medium wurde mit dem gewünschten Klon

angeimpft und die Kultur über Nacht bei 37°C im Schüttler hochgezogen. Aus Vorkultur und

LB-Medium wurde am folgenden Morgen im Verhältnis 1 : 10 eine Hauptkultur von 2-8 l

hergestellt.

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