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Nachweisreaktion. Bei der Nachweisreaktion kommt es zu einer Lichtemission, die auf einem

Film festgehalten wird (Abb. C1).

Abb. C1: Prinzip des Westernblots

An das nachzuweisende Protein auf der

Membran bindet zuerst ein Antikörper

gegen das Protein, danach ein Antikörer

gegen den Erstantikörper. Der Zweitanti-

körper trägt die Peroxidase, die die

Nachweisreaktion katalysiert.

Für den Transfer der Proteine wird eine PVDF-Membran zuerst 30 s lang in Methanol

aktiviert. Dann wird sie mit dem SDS-Gel und Whatman-Papier nach der SDS-

Gelelektrophorese zwischen Anode und Kathode einer Blotapparatur gelegt. Bei einer

konstanten Spannung von 20 V (35 min) werden die Proteine vom Gel auf die Membran

übertragen.

Die unspezifischen Bindungsstellen der Membran werden anschließend mit einer 5 %

Milchpulverlösung (15 min, RT) geblockt und der Blot mit TTBS gewaschen (5 min , RT).

Der spezifische Erstantikörper wird in einer Verdünnung von 1:500 hinzu gegeben und mit

dem Blot über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach erneutem Waschen des Blots (3 x 10 min, RT)

wird der spezifische Zweitantikörper in einer Verdünnung von 1:3000 zugegeben (1h, RT).

Für die Nachweisreaktion wird der Blot 30 s lang in „Enhanced Chemiluminescence“-Lösung

(ECL-Lösung) geschwenkt. Die ECL-Lösung enthält Luminol, p-Cumarsäure und H

. Die

Meerrettichperoxidase katalysiert die Reaktion von Luminol zu 3-Aminophtalsäure, wobei es

zur Lichtemission kommt. Das emittierte Licht wird durch Belichtung eines ECL-Films

nachgewiesen, der dann entwickelt und fixiert wird. Die Blotmembran kann zur Kontrolle der

Proteinbanden reversibel mit Ponceau S-Lösung gefärbt werden.

1. Ak

2. Ak mit

Peroxidase

Nachweis-

reaktion

Protein

Membran

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